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基于免疫磁性外泌体PCR的超灵敏检测方法，可用于阿尔茨海默病的即时诊断

发布日期：2024-04-08点击量：120次编辑：szbyjy_admin

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种以淀粉样蛋白-β（Aβ）斑块和磷酸化tau神经原纤维缠结沉积为病理特征的神经退行性疾病。该病理过程涉及Aβ斑块（“A”），tau蛋白缠结（“T”）以及进行性神经变性（“N”），而评估大脑中的ATN生物标志物水平可用于AD的诊断和分期。基于血浆的AD生物标志物（如血浆Aβ₁₋₄₂、p-tau¹⁸¹、p-tau²¹⁷等）提供了成本低廉、侵入性较小的AD检测方法。目前基于血浆来源CD63⁺外泌体上标志物水平与AD病程发展的相关性以及它们能否用于AD诊断的问题仍然不清楚。

近期，华中科技大学武汉光电国家研究中心骆海明教授团队开发了一种基于免疫磁性外泌体聚合酶链式反应（immunomagnetic exosomal PCR，iMEP）的超灵敏检测方法，实现了对血浆外泌体上多种AD生物标志物的检测，并证实了血浆外泌体上AD标志物也可以作为AD临床诊断的潜在标志物。相关工作以“Sensitive detection of multiple blood biomarkers via immunomagnetic exosomal PCR for the diagnosis of Alzheimer’s disease”为题，发表在Science Advances期刊上。

该检测体系包括了血浆外泌体的提取与定量、外泌体生物标志物的免疫识别以及实时荧光定量PCR（图1）。利用该检测方法可以对血浆外泌体上AD相关标志物（Aβ₁₋₄₂、Aβ₁₋₄₀、p-tau³⁹⁶,⁴⁰⁴和p-tau¹⁸¹）进行超灵敏检测，能够准确、有效地区分AD患者和健康者，其灵敏度和特异度高达95%。

图1 免疫磁性外泌体PCR检测血液生物标志物的示意图

通过设计立足点介导的链置换反应去除抗体与DNA偶联产物中多余的没有结合的抗体，对比抗体-DNA偶联物纯化前后检测到的背景荧光信号和灵敏度，研究团队发现该纯化策略可以提升检测的准确度及灵敏度。该方法可检测的生物标志物浓度低至10 fg/mL，其检测灵敏度是传统ELISA的1000倍（图2）。

图2 免疫磁性外泌体PCR（iMEP）检测性能的评估

血浆外泌体是活细胞分泌到循环血液中的细胞外囊泡，是细胞间通讯的重要介质，可以通过传递蛋白质等物质来反映大脑生理和疾病状态。通过对比AD患者和健康者的神经元衍生的外泌体（NCAM⁺外泌体）与血浆外泌体（CD63⁺外泌体）中的AD生物标志物检测水平，研究团队发现血浆外泌体中的AD生物标志物水平显著高于神经元来源外泌体，该结果说明了血浆外泌体可以更好地区分AD患者与健康者（图3）。

图3 iMEP在血浆外泌体和神经元衍生外泌体中检测性能的比较

为了进一步评估iMEP检测方法的临床适用性，该团队分别利用iMEP与传统ELISA（exosome-ELISA、plasma-ELISA）测定临床样本中AD生物标志物的水平，发现iMEP的检测灵敏度明显高于ELISA。而且，血浆外泌体中Aβ₁₋₄₂水平与AD病程的发展呈正相关，轻度至中度和重度AD患者的血浆外泌体Aβ₁₋₄₂水平显著高于健康个体，表明该方法或许可以用于AD病程的监测（图4）。

图4 iMEP在临床血浆外泌体中多种AD生物标志物的检测性能

综上所述，该研究提出一种基于抗体-DNA偶联物的iMEP检测体系，用于超灵敏检测临床血浆外泌体中的淀粉样蛋白-β（Aβ₁₋₄₂和Aβ₁₋₄₀）和磷酸化tau（p-tau³⁹⁶,⁴⁰⁴和p-tau¹⁸¹）。该iMEP检测方法具有低背景信号、高特异度和高灵敏度的独特优势，可广泛应用于各种外泌体的检测，并不局限于外泌体中AD相关的蛋白质靶标，还可进一步扩展到外泌体中的脂质、炎症和代谢相关靶标的检测。然而，本研究中检测的临床样本量有限，考虑到后期的临床前应用，需要大批量临床样本进一步验证并建立iMEP可信的检测标准。iMEP检测技术还将适用于量化外泌体中与神经退行性疾病、炎症、心血管疾病和癌症等疾病的发病机制相关的多种生物标志物的水平。

论文链接：

https://doi.org/10.1126/sciadv.abm3088

来源：IVD分享库

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